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The Science behind Golden Rice

金稻米的科学依据

填补空白的技术

金稻米技术的产生基于一个简单的 原理,水稻只能在绿叶组织中合成 β-胡萝卜素,而在被食用的胚乳中 却没有,可是这个两步的生物合成 途径确实存在于粮食中。仅仅通过 转入两种酶的基因:八氢番茄红素 合成酶(PSY)和八氢番茄红素脱氢酶 (crt I),粮食中可以合成β-胡萝卜素 的途径就能被重新激活,β-胡萝卜 素就能因此在被食用的胚乳中制造 并积累。

Carotenoid biosynthesis

类胡萝卜素及其衍生物包括数目 庞大的分子以及大量的酶和辅助 因子。源自这一重要途径的化合 物包括植物激素,如脱落酸(abcisic) 和赤霉素,维生素E,部分叶绿素分 子和许多天然色素。其中少量类胡 萝卜素具有前体维生素A活性。

更详尽的科学背景

所有能富聚类胡萝卜素的植物组织都存 在类胡萝卜素整合机制的体系中,包括 结晶,油沉积,膜扩散或蛋白脂质吸收 。在不合成类胡萝卜素的水稻胚乳中由 于脂类构成比较低,因此缺乏类胡萝卜 素沉积的条件。该技术的另一个限制是 ,在金稻米中缺乏类胡萝卜素前体物的 供应。此外,还有许多人认为,在胚乳 中完全缺乏类胡萝卜素生物合成途径。

由于这些限制因素,金稻米的发展经历 了一段滞后的阶段,直至研究者积累了 足够的科学数据,才激励Peter Beyer和Ingo Potrykus共同 奋斗,试图进行这项看似无法实现的科 研努力。他们具有突破性的研究成果表 明,只需要转入两个基因就能使金稻米 能在胚乳中制造胡萝卜素,使上面所述 及的限制条件不影响该项技术(Ye等,2000年 )。其中第一个转基因编码八氢番茄红 素合成酶(PSY),通过应用内源性合成双 香业基(geranylgeranyl)二磷酸酯,形成八氢番茄 红素,一种带有三烯生色基团的无色胡萝 卜素(Burkhard等,1997年)。另一个转基因编码 细菌胡萝卜素脱氢酶(CRT I)通过加入4个双 键形成共轭结合。这两个基因共同表达后 形成番茄红素,这是一种含有十一个双键 (undecaene)的生色基团的红色化合物。在任何 不同转化和遗传背景的水稻中,番茄红素 从未被观察到,相反却发现了α-和β-胡萝 卜素以及大量含氧类胡萝卜素的存在,如 叶黄素和玉米黄素。胚乳中的类胡萝卜素 样本显示,两个转基因自身的酶活动已超 出了预期的终点。由Peter Beyer实验室的同事撰写 的对该机制的详细分析在近期的植物生理 学杂志上予以发表(Schaub等, 2005年),他们的 研究结果解释了一些细节如下:

Genetic Engineering in Golden Rice

类胡萝卜素生物合成的前体分子是双香 业基二磷酸酯基。两条实线所框出的限 速步骤因为两个转基因的合作表达而被 打破,因而不再需要通过去饱和酶PDS和ZDS.

一种解释是,类胡萝卜素途径下游的一些 酶,如番茄红素环化酶(LCYs)和α -和β -胡萝 卜素羟化酶 (hydroxylases, HYDs),可在野生型水稻胚乳 中生成,而八氢番茄红素合成酶(PSY)以及 一种或两种去饱和酶PDS和ZDS却不能。转基因作 物中由八氢番茄红素合成酶和细菌胡萝卜素 脱氢酶催化合成的番茄红素的为下游的酶提 供底物,使类胡萝卜素的合成成为可能。事 实上,单由八氢番茄红素合成酶的即可合成 氢番茄红素,但不能合成去饱和酶的作用产 物(Burkhard等,1997年),这个结果为至少一个去饱 和酶PDS酶活性的缺失提供了证据。同样,CRT I本 身并不会生产有任何颜色的水稻胚乳,因为 缺少八氢番茄红素合成酶的(PSY)活性。

另一种解释是,转基因的存在反馈诱导了内 源性生物合成类胡萝卜素的基因表达。这种 情况在只有CRT I表达的番茄果实中得到证明。 此外,β-胡萝卜素增加,而非番茄红素,能 上调内源性合成类胡萝卜素的基因表达,却 对八氢番茄红素合成酶(PSY)的表达产生抑制 (Römer 等,2000年)。像这种依赖于CRT I的上调机制可能 基于这样一个事实,即作物的去饱和酶,PDS和ZDS, 共同作用产生一个四联体形式的番茄红素, 又称为番茄红素原(Bartley 等,1999年),随后被一个 最近被确定的异构酶,番茄红素-顺式-反 式异构酶(CRTISO),异构化为反式番茄红素 (Isaacson 等, 2002, 2004年; Park等., 2002年)。与此相反,细菌胡萝 卜素脱氢酶(CRT I)参与作用形成特殊的全反 式番茄红素。同样,通过在水仙花中人工抑 制LCY, 造成全反式番茄红素累积,从中我们能够 持续观察到这种特殊的类胡萝卜素在基因和 蛋白质水平的升高,同时总的类胡萝卜素含 量也明显升高(Al-Babili 等, 1999年)。

含有构成表达CRT I的转基因植物可以用来解释金 稻米这一基因表型。通过确定内源性类胡萝 卜素的生物合成基因的表达及产物的水平, 来获得成功的转基因品种。可以想象, 转入 后表达的CRT I通过靶组织的反馈调节环路去促进 类胡萝卜素的生物合成相关基因的转录激活 。这个调节环路, 由4-顺式番茄红素(tetra-cis-lycopene) 的缺失来诱发,正常来说4-顺式番茄红素是由2种 植物去饱和酶(PDS和ZDS)或者全反式番茄红素 参与衍生而来,这个反应由CRT I催化。番茄红素 异构体不仅代表传统的中间体,而且还发挥 重要的调节作用。在植物和蓝藻中新发现的 参与类胡萝卜素合成途径的酶CRTISO(Isaacson 等, 2002, 2004年; Park 等, 2002年),有可能作为调节分子对合成途径起到 补充作用。在这种情况下,金稻米由于转录激 活整个类胡萝卜素生物合成途径而表现为橙黄 色。

在另一种情况下,有活性的下游酶,如环化 酶和羟化酶,可能存在于野生型水稻胚乳, 这又解释了通过转入上游基因,番茄红素能 在合成后立即进入下一步合成的原因。野生 型水稻胚乳仅含低水平的叶黄素合成所需的 所有mRNA,即PSY, PDS, ZDS, CRTISO, β-LCY, ε;-LCY, β-HYD, and ε-HYD。基于PCR结果 ,同时考虑到该方法的敏感性,PSY的转录被有 效地抑制,这和合成途径中,PSY表达对产生金 稻米这一基因表型,是需要但非必要的事实相 符合。 PSY单独表达就能使金稻米中合成我们需 要的八氢番茄红素(Burkhard等,1997年)。

荧光实时定量PCR显示,野生型胚乳中对于CRT I的 基本要求,显然与存在的PDS 和ZDS的转录相互冲突 。 这可能是由于仅表现为低水平表达的蛋白和 酶活性,而不是mRNA水平。由于低水平表达,以 及没有放射性胡萝卜素的底物,对PDS和ZDS复杂的 反应机制的探讨是不现实的。现在的研究只好 使用转基因的方法进行植物体内实验,而非体 外实验。 胚乳特异表达的是PDS / ZDS系统,而不是CRT I ,在水稻胚乳产生可供参考比较的类胡萝卜素 的颜色水平。 因此,水稻胚乳为植物去饱和酶 的活性提供了复杂的需求。

PDS 需要还原链,应用醌,一个醌还原酶,和分子 氧作为终端电子受体(Beyer等,1989年; Mayer等,1990年; Nievelstein等 ,1995年),与通过immutans突变的拟南芥识别的氧化酶 相连(见综述, Kuntz, 2004年)。这种还原途径对于非 绿色含类胡萝卜素的组织尤其重要,如胚乳, 而光合电子传递被认为在叶绿体中发挥类似的 作用。因此,一种解释是,当PSY作为唯一的转基 因表达时,胚乳中由于PDS/ZDS系统表达过低而无法 产生有颜色的类胡萝卜素。这已经表明,与PSY的 作用相比较,CRTI没有限制反应速度,并有能力对 大量的八氢番茄红素发挥去饱和作用,从而增 加β-胡萝卜素的积累(Paine等,2005年)。

CRT I的主要序列与植物型的去饱和酶并无关联。这 或许可以解释其对辅助因子的需要,因此可能比 植物去饱和酶在胚乳中更有效的发挥作用。另一 方面,同样在胚乳中有活性的CRTISO,似乎也来源于CRT I (Isaacson等, 2002年; Park等., 2002年)。

PSY, PDS和ZDS在水稻胚乳中表达启动聚顺式胡萝卜素去 饱和途径,但β-胡萝卜素形成主要是全反式,并 伴随典型的顺式异构体,目前,以9-顺式的异构体 较多。此外,转基因植物胚乳依靠CRT I的催化去饱 和,控制β-胡萝卜素相同的同分异构体比值,这 表明水稻CRTISO触发的异构体形成被控制在一个特定 的比例,与其在体外活动相符合(Isaacson等,2004年) 。CRTISO的活动对循环末端形成起了很重要的作用。 当缺乏CRTISO时,循环胡萝卜素和衍生物叶黄素不会 在非绿叶组织中生成,这在缺失有功能的CRTISO的桔 突变番茄果实和从拟南芥CCR 2突变得到的黄化质体 中已被证明。

显然, LCY的活性和不同类别的β-HYD的活性(见综述 ,田和DellaPenna,2004年)依靠水稻胚乳中基因而各自表 达。目前为止所有的水稻遗传背景的测试显示, 对酶活动的补充在沿下游途径的进行中并不需要 。 此外,稻米LCYs的活动没有被证明是限速步骤, 因为番茄红素没有积累。 因此,金稻米是因为内 在的大米环化酶活动呈现黄色。 荧光定量实时PCR对 转基因水稻胚乳中分离出的RNA的分析,没有说明在 转基因水稻中,存在一个可能会影响类胡萝卜素 生物合成基因所表达的反馈调节环,因为与野生 型相比,所有的相应的mRNA水平没有改变。

尽管水稻的绿叶组织中胡萝卜素醇含量增加,但 它与表达CRT I拟南芥和胡萝卜素醇的构成情况基本 相似。 有这样两种情况,在叶黄体素下降时,β -胡 萝卜素及其衍生胡萝卜素醇增加,作为部分补偿。 这种情况也出现在经转化后表达CRT I的烟草BY2细胞中, 但这里类胡萝卜素成分没有发生类似的变化,这可 能是因为BY2细胞不积累叶黄素和玉米黄素。在水稻 和拟南芥叶片中胡萝卜素醇水平的变化因条件不同 有多种变化,并与CRT I表达水平呈负相关。底物向哪 一种胡萝卜素醇形成途径流动,是由两个LCYs 控制的 ,LCYs参与将番茄红素转换成β-胡萝卜素和α-胡萝卜素 。 但是,用以监测类胡萝卜素组成变化的类环化酶 的转录水平没有发生重大变化。 因此,我们相信, 番茄红素的几何异构状态对β- 或ε- 环的形成具有一 定影响。

缺乏CRTISO的番茄和拟南芥的突变体也会在叶片中产生 较多的β -胡萝卜素源性胡萝卜素醇(Isaacson等,2002年;Park 等,2002年)。因此,最有可能观察到的是酶催化水 平和几何异构的番茄红素,而不是基因表达水平。 这些结果为野生型中只存在类胡萝卜素生物合成的 组织提供了证据,如,叶片。而在缺乏类胡萝卜素 的野生型中的转基因作物胚乳中则不可能观察到。

叶片中观察到叶黄素减少,在理论上可能降低光合 作用。作为最丰富的胡萝卜素醇,其主要是附着在 光收集复合体II发挥作用。在拟南芥突变体中已经发 现叶黄素含量下降引起PSII天线尺寸减小(Lokstein等, 2002年 )。这表明叶黄素具有对天线结构优化的能力,同 时确保稳定有效的捕光性。因此,我们选择在新一 代金稻米中应用组织特异性启动子控制CRT I的表达 (Paine等 ,2005年; Al-Babili等,已投出; TTC Hoa and P Schaub, 未发表结果)。

第一代金稻米

金稻米技术第一个突破,是1999年复活期间Peter Beyer 和 Ingo Potrykus之间的合作成果(Ye 等, Science 287:303-5, 2000)。这篇论文 为在稻米中制造β -胡萝卜素提供了证明。在 当时人们仍然相信,除八氢番茄红素合成酶 和胡萝卜素脱氢酶以外,还需要第三种酶--番 茄红素环化酶去完成整个生物合成途径。

基于已有的理论依据,科学家们立即着手发 展能提高类胡萝卜素生产和积累的育种方法 ,因为当时人们已经认识到在相对缺乏均衡 饮食的目标人群中,合理食用量水平的金稻 米还不能完全提供每日所需的前体维生素A (1.6 微 克/克)。尽管一些东南亚地区的居民可以获得 均衡的饮食,但很多的穷困的人却没有这个 条件,在实际生活中,一些边远地区的居民 是依靠食用大米,提供每日80%的热量需求。

共同的努力促成后来我们所称的第一代金稻 米的发展,也被称为SGR1。这一代金稻米仅含 有来源于水仙花八氢番茄红素合成酶 (PSY) 基因 和来源于噬夏孢欧文氏菌的细菌的胡萝卜素 脱氢酶( crtI) 基因。此外,这两个转基因只在水 稻胚乳表达。温室中生长的转基因作物产生 的类胡萝卜素水平与预实验结果(1-2 微克/克) 相 近,而在土地中生长的金稻米,其类胡萝卜 素水平平均可达到6 微克/克,这可能跟作物生 长条件的改善和选种过程有关。配合每日摄 入适量的蔬菜和鱼类或其他肉类(正如目前 他们的饮食摄入量),这种水平的类胡萝卜 素含量预计将能够满足儿童每日推荐摄入量 。

Golden Rice 2 construct

生物合成金稻米的基因结构 。RB, T-DNA 右边界序列;谷氨酸, 水 稻胚乳特异性谷蛋白启动子; tpSSU,豌 豆核酮糖二磷酸羧化酶的,促叶绿体 本体化小亚基转化肽; 胭脂碱合成终止 酶; Psy, 八氢番茄红素合成酶基因,来自 黄水仙 (GR1)或玉米(GR2); Ubi1, 玉米泛素启动子;Pmi,磷酸甘露糖异构 酶基因来自大肠杆菌 为正选择(GR2); LB ,T - DNA左边界序列。

新一代金稻米

第一代金稻米,提供了为预防维生素A缺乏 症的宝贵的理念,但研究者也认识到,如 果要更有效的预防维生素A缺乏症,稻米还 需要含有更高水平的β-胡萝卜素含量。因 为在整个过程中只需要两个转基因,因此 合乎逻辑的提高金稻米中类胡萝卜素积累 的做法是确定生物合成途径的关键问题, 以及对八氢番茄红素合成酶(PSY)和胡萝卜 素脱氢酶(CRT I)两种基因产物酶活性的调节 问题。 这一切可以通过应用从其他来源的同 源基因替代法或修改其调节区域去进行研究 。

在大多数多步生物合成途径中存在一个限制 性步骤。金稻米技术的瓶颈问题就是如何调 控八氢番茄红素合成酶(PSY)的酶活性。在 尝试转入来自不同来源的八氢番茄红素合成 酶基因(PSY)后,研究者发现来自玉米和水稻 的基因能获得最好的效果(Paine等, 2005年)。在 新一代金稻米中类胡萝卜素的积累可多达37微 克/克,其中β-胡萝卜素达到了31微克/克(相对 于只有1.6微克/克 类胡萝卜素的第一代的金稻米 有了很大的提高)。

1-3岁儿童维生素A的每日推荐量为300微克(通常 半数的每日推荐量已经足够将维生素A维持在 正常水平)。基于β-胡萝卜素与视黄醇当量 的比率为12 :1,只要72克新一代的金稻米即可 提供半数维生素A的每日推荐量。根据一些国 家的稻米消耗水平,每个儿童每日进食100-200克 大米,这些金稻米提供儿童半数维生素A的每 日推荐量是完全合适的。

GR2

该图像清楚地表明,金稻米从概念证 明阶段以来,所取得的进展。新一代 的金稻米,也称为GR2, 所含的β-胡萝卜素 水平将能提供东南亚的健康儿童所需的 前体维生素A。

引用文献

A number of historically relevant papers

  • Al-Babili S, Hugueney P, Schledz M, Welsch R, Frohnmeyer H, Laule O, Beyer P (2000) Identification of a novel gene coding for neoxanthin synthase from Solanum tuberosum. FEBS Lett 485:168-172.
  • Al-Babili S, von Lintig J, Haubruck H, Beyer P (1996) A novel, soluble form of phytoene desaturase from Narcissus pseudonarcissus chromoplasts is Hsp70-complexed and competent for flavinylation, membrane association and enzymatic activation. Plant J 9:601-612.
  • Al-Babili S, Ye X, Lucca P, Potrykus I, Beyer P (2001) Biosynthesis of beta-carotene (provitamin A) in rice endosperm achieved by genetic engineering. Novartis Found Symp 236:219-228; discussion 228-232.
  • Bartley G, Kumle A, Beyer P, Scolnik P (1993) Functional analysis and purification of enzymes for carotenoid biosynthesis expressed in photosynthetic bacteria. Methods Enzymol 214:374-385.
  • Bartley GE, Scolnik PA, Beyer P (1999) Two Arabidopsis thaliana carotene desaturases, phytoene desaturase and zeta-carotene desaturase, expressed in Escherichia coli, catalyze a poly-cis pathway to yield pro-lycopene. Eur J Biochem 259:396-403.
  • Belingheri L, Beyer P, Kleinig H, Gleizes M (1991) Solubilization and partial purification of squalene synthase from daffodil microsomal membranes. FEBS Lett 292:34-36.
  • Beyer P, Al-Babili S, Ye X, Lucca P, Schaub P, Welsch R, Potrykus I (2002) Golden Rice: Introducing the beta-carotene biosynthesis pathway into rice endosperm by genetic engineering to defeat vitamin A deficiency. J Nutr 132:506S-510.
  • Beyer P, Kroncke U, Nievelstein V (1991) On the mechanism of the lycopene isomerase/cyclase reaction in Narcissus pseudonarcissus L. chromoplasts. J Biol Chem 266:17072-17078.
  • Beyer P, Mayer M, Kleinig H (1989) Molecular oxygen and the state of geometric isomerism of intermediates are essential in the carotene desaturation and cyclization reactions in daffodil chromoplasts. Eur J Biochem 184:141-150.
  • Bonk M, Hoffmann B, Von Lintig J, Schledz M, Al-Babili S, Hobeika E, Kleinig H, Beyer P (1997) Chloroplast import of four carotenoid biosynthetic enzymes in vitro reveals differential fates prior to membrane binding and oligomeric assembly. Eur J Biochem 247:942-950.
  • Bonk M, Tadros M, Vandekerckhove J, Al-Babili S, Beyer P (1996) Purification and characterization of chaperonin 60 and heat-shock protein 70 from chromoplasts of Narcissus pseudonarcissus (Involvement of heat-shock protein 70 in a soluble protein complex containing phytoene desaturase). Plant Physiology 111:931-939.
  • Burkhardt P, Beyer P, Wunn J, Kloti A, Armstrong G, Schledz M, von Lintig J, Potrykus I (1997) Transgenic rice (Oryza sativa)endosperm expressing daffodil (Narcissus pseudonarcissus) phytoene synthase accumulates phytoene, a key intermediate of provitamin A biosynthesis. Plant J 11:1071-1078.
  • Hoa TTC, Al-Babili S, Schaub P, Potrykus I, Beyer P (2003) Golden indica and japonica rice lines amenable to deregulation. Plant Physiology 133:161-169.
  • Hundle B, Beyer P, Kleinig H, Englert G, Hearst J (1991) Carotenoids of Erwinia herbicola and an Escherichia coli HB101 strain carrying the Erwinia herbicola carotenoid gene cluster. Photochem Photobiol 54:89-93.
  • Hundle B, O'Brien D, Alberti M, Beyer P, Hearst J (1992) Functional expression of zeaxanthin glucosyltransferase from Erwinia herbicola and a proposed uridine diphosphate binding site. Proc Natl Acad Sci USA 89:9321-9325.
  • Hundle B, O'Brien D, Beyer P, Kleinig H, Hearst J (1993) In vitro expression and activity of lycopene cyclase and beta-carotene hydroxylase from Erwinia herbicola. FEBS Lett 315:329-334.
  • Mayer M, Beyer P, Kleinig H (1990) Quinone compounds are able to replace molecular oxygen as terminal electron acceptor in phytoene desaturation in chromoplasts of Narcissus pseudonarcissus L. Eur J Biochem 191:359-363.
  • Nievelstein V, Vandekerchove J, Tadros M, Lintig J, Nitschke W, Beyer P (1995) Carotene desaturation is linked to a respiratory redox pathway in Narcissus pseudonarcissus chromoplast membranes. Involvement of a 23-kDa oxygen-evolving-complex-like protein. Eur J Biochem 233:864-872.
  • Paine JA, Shipton CA, Chaggar S, Howells RM, Kennedy MJ, Vernon G, Wright SY, Hinchliffe E, Adams JL, Silverstone AL, Drake R (2005) A new version of Golden Rice with increased pro-vitamin A content. Nature Biotechnology 23:482-487.
  • Rabbani S, Beyer P, Lintig Jv, Hugueney P, Kleinig H (1998) Induced beta-carotene synthesis driven by triacylglycerol deposition in the unicellular alga Dunaliella bardawil. Plant Physiology 116:1239-1248.
  • Schaub P, Al-Babili S, Drake R, Beyer P (2005) Why is Golden Rice golden (yellow) instead of red. Plant Physiology 10.1104/pp.104.057927 (published online 8 April 2005).
  • Schledz M, Al-Babili S, von Lintig J, Haubruck H, Rabbani S, Kleinig H, Beyer P (1996) Phytoene synthase from Narcissus pseudonarcissus: functional expression, galactolipid requirement, topological distribution in chromoplasts and induction during flowering. Plant J 10:781-792.
  • Schledz M, Seidler A, Beyer P, Neuhaus G (2001) A novel phytyltransferase from Synechocystis sp PCC 6803 involved in tocopherol biosynthesis. FEBS Lett 499:15-20.
  • Schreier PH, Seftor EA, Schell J, Bohnert HJ (1985) The use of nuclear-encoded sequences to direct the light-regulated synthesis and transport of a foreign protein into plant chloroplasts EMBO J 4:25-32.
  • Welsch R, Beyer P, Hugueney P, Kleinig H, von Lintig J (2000) Regulation and activation of phytoene synthase, a key enzyme in carotenoid biosynthesis, during photomorphogenesis. Planta 211:846-854.
  • Welsch R, Medina J, Giuliano G, Beyer P, Von Lintig J (2003) Structural and functional characterization of the phytoene synthase promoter from Arabidopsis thaliana. Planta 216:523-534.
  • Ye X, Al-Babili S, Klöti A, Zhang J, Lucca P, Beyer P, Potrykus I (2000) Engineering the provitamin A (beta-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm. Science 287:303-305.

Carotenoids in nature: insights from plants and beyond

A scientific backgrounder

For those interested in scientific details about carotenoids, here's a scientific review that covers the mechanisms controlling (1) the first committed step in phytoene biosynthesis, (2) flux through the branch to synthesis of a- and b-carotenes and (3) metabolic feedback signalling within and between the carotenoid, MEP and ABA pathways; by Christopher Cazzonelli, published in the journal Functional Plant Biology in 2011 (with permission from CSIRO Publishing) pdf